Prolifération de cellules précurseurs d'ostéoblastes à la surface de nanofils de TiO2 cultivés anodiquement sur un β

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 7895 (2022) Citer cet article

669 accès

1 Citations

4 Altmétrique

Détails des métriques

Des études ont montré que les nanotubes de TiO2 (TNT) à croissance anodique présentent une excellente biocompatibilité. Cependant, les nanofils de TiO2 (TNW) ont reçu moins d'attention. L'objectif de cette étude était d'étudier la prolifération des cellules précurseurs d'ostéoblastes sur les surfaces de TNW cultivées par anodisation électrochimique d'un alliage Ti-35Nb-7Zr-5Ta (TNZT). Des surfaces de TNT et de TNZT plates ont été utilisées comme échantillons de contrôle. Les cellules MC3T3-E1 ont été cultivées sur les surfaces des échantillons pendant jusqu'à 5 jours, et la viabilité et la prolifération cellulaires ont été étudiées à l'aide de la microscopie à fluorescence, d'un dosage colorimétrique et d'une microscopie électronique à balayage. Les résultats ont montré des taux de prolifération cellulaire inférieurs sur la surface TNW par rapport aux échantillons témoins sans différences significatives dans la survie des cellules entre les conditions expérimentales. Les mesures d'angles de contact ont montré un bon niveau d'hydrophilie pour les TNW, cependant, leur diamètre relativement mince et leur densité élevée peuvent avoir affecté la prolifération cellulaire. Bien que des recherches supplémentaires soient nécessaires pour comprendre tous les paramètres affectant la biocompatibilité, ces nanostructures de TiO2 pourraient représenter des outils prometteurs pour le traitement des défauts osseux et la régénération du tissu osseux, entre autres applications.

Le titane et ses alliages ont une résistance spécifique élevée (rapport résistance/poids) et la meilleure biocompatibilité parmi les métaux. Le titane forme naturellement un oxyde (TiO2) à sa surface, qui le protège efficacement de la corrosion, même en milieu aqueux. Ainsi, malgré ses coûts de production relativement élevés, le titane est avantageux pour de nombreuses applications, notamment dans les industries aérospatiale1 et biomédicale2. À basse température, le titane pur a une structure cristalline hexagonale compacte, connue sous le nom de phase α, qui subit une transformation allotropique à 882 ° C en une structure cubique centrée sur le corps, connue sous le nom de phase β. Pour stabiliser la phase β à des températures plus basses, des éléments d'alliage tels que Mo, Nb, V et Ta peuvent être ajoutés au titane. Les alliages de titane sont largement utilisés pour fabriquer des matériaux biomédicaux, en particulier ceux utilisés pour remplacer les tissus durs. La phase β du titane présente un module d'élasticité considérablement faible, ce qui augmente la compatibilité mécanique entre l'implant et l'os. Le module d'élasticité d'un implant doit être aussi proche que possible de celui de l'os pour réduire l'effet de protection contre les contraintes3, qui est un problème grave pouvant entraîner une perte de masse osseuse (ostéopénie) et éventuellement conduire à une défaillance de l'implant. Les modules d'élasticité des biomatériaux couramment utilisés tels que le titane commercialement pur ou l'acier inoxydable peuvent être jusqu'à six fois supérieurs à ceux de l'os4. Ces dernières années, les alliages de titane de type β, basés sur le système quaternaire Ti-Nb-Zr-Ta, ont été étudiés pour des applications d'implants chirurgicaux5 en raison de leur biocompatibilité supérieure et de leurs faibles modules élastiques. L'un de ces matériaux est le Ti-35Nb-7Zr-5Ta (TNZT), un alliage β-titane métastable à faible module d'élasticité (environ 60 GPa6,7) exempt d'éléments toxiques. Une autre préoccupation critique est la capacité de l'implant à s'ostéointégrer, c'est-à-dire à former une fixation stable avec l'os. Lorsqu'un implant est inséré dans le corps humain, il génère une réponse inflammatoire, qui se termine par l'encapsulation de l'implant par des molécules de collagène. Cette formation de capsule est difficile à éviter, mais les matériaux à base de titane présentent une encapsulation minimale par rapport à d'autres métaux biomédicaux tels que l'acier inoxydable et les alliages Co-Cr2.

Malgré les avantages du titane par rapport aux autres biomatériaux métalliques, des progrès supplémentaires sont nécessaires pour améliorer l'ostéointégration et réduire le taux de rejet des implants. La biocompatibilité de l'implant étant étroitement liée à sa chimie de surface et à sa topographie, les modifications de surface du titane ont été largement étudiées8,9, y compris la croissance de nanotubes de TiO2 (TNT)10 par anodisation électrochimique. Ce dernier implique l'application d'un potentiel électrique entre le substrat de titane ou d'alliage de titane (anode) et une contre-électrode (cathode), séparés par un électrolyte contenant du fluorure. La formation de TNT lors de l'anodisation est due à une combinaison de processus simultanés, qui peuvent être résumés comme une compétition entre la croissance assistée par champ de la couche de TiO2 et la dissolution chimique de TiO2 par l'électrolyte contenant du fluorure, se produisant préférentiellement à la base du tube11. Lors de la croissance anodique des TNT, des nanofils de TiO2 (TNW) peuvent se former sur la partie supérieure des TNT par un processus de division verticale des TNT, connu sous le nom de "bamboo-splitting model"12. La nanostructure finale est composée de TNT avec des TNW sur le dessus, et la longueur des TNW peut être encore plus longue que celle des TNT. Les paramètres d'anodisation requis pour la formation des TNW peuvent varier en fonction de la composition du substrat (anode) et l'alliage TNZT favorise leur formation13. Les TNW peuvent également être synthétisés par d'autres techniques, telles que l'électrofilage, l'ablation au laser et l'oxydation14. Le terme nanofibres de TiO2 (TNF) est également utilisé dans la littérature pour décrire des structures similaires aux TNW. Bien que la différence entre ces deux termes ne soit pas claire, les TNW ont généralement des diamètres de l'ordre de dizaines de nanomètres, tandis que les TNF ont des diamètres plus grands allant jusqu'à 1 μm15. Les TNW et les TNF ont une surface élevée, ce qui peut aider les cellules à se fixer et à proliférer. Des études sur la biocompatibilité des échafaudages fibreux polymériques16 ont montré que ce type de morphologie offre un environnement favorable pour les cellules, en raison de sa similitude avec la matrice extracellulaire osseuse native. De plus, les TNW à croissance anodique ont l'avantage de pouvoir être facilement cultivés même sur des implants aux géométries complexes et, comme ils se développent directement à partir du substrat, aucune étape supplémentaire n'est nécessaire pour les fixer à la surface de l'implant.

Un nombre important d'études17 ont montré que les TNT sont des matériaux biomédicaux prometteurs qui fournissent un bon support pour l'attachement et la prolifération cellulaire. Cependant, la biocompatibilité des revêtements TNW (ou TNF) a reçu peu d'attention dans la littérature ; les études existantes présentent de nombreuses différences dans les méthodes, les conceptions et les résultats, et sont donc difficiles à comparer18,19,20,21,22. Ces études sont résumées dans le tableau 1. De plus, la plupart des études sur la fabrication et l'application de ces nanostructures de TiO2 ont utilisé CP-Ti ou Ti-6Al-4V, qui sont les alliages les plus traditionnels et les plus couramment utilisés. En attendant, une plus grande attention devrait être accordée aux alliages de titane de type β à faible module, tels que le TNZT, conçus pour des applications biomédicales. En plus de sa compatibilité mécanique améliorée avec l'os, l'alliage TNZT est avantageux par rapport au CP-Ti pour la croissance anodique des nanostructures de TiO2, produisant des TNT trois fois plus longs et montrant la formation beaucoup plus facile des TNW13. À notre connaissance, aucune étude n'a exploré le comportement cellulaire à la surface des TNW qui ont été anodiquement cultivés sur des alliages de titane biomédicaux de type β. Par conséquent, cette étude visait à étudier la biocompatibilité des TNW cultivés anodiquement sur l'alliage TNZT en cultivant des cellules précurseurs ostéoblastiques sur leurs surfaces. Des surfaces revêtues de TNT et des surfaces planes de TNZT ont été utilisées comme échantillons de contrôle.

L'alliage Ti-35Nb-7Zr-5Ta (% en poids) a été produit par fusion à l'arc voltaïque d'éléments purs sur un creuset en cuivre refroidi à l'eau sous une atmosphère d'Ar. Le lingot a été refondu au moins 10 fois et retourné sur le creuset après chaque fois pour assurer l'homogénéité. Par la suite, il a été encapsulé dans un tube en verre de quartz rempli d'Ar et homogénéisé à 1000 ° C pendant 24 h pour éliminer la microségrégation des éléments. Le lingot a ensuite été laminé à froid en plusieurs passes pour réduire l'épaisseur d'environ 75 %, ce qui a donné une plaque d'une épaisseur de 2 mm. La plaque a ensuite été recuite sous une atmosphère d'Ar à 800 ° C (au-dessus de la température β-transus) pendant 1 h, suivie d'une trempe à l'eau.

La plaque d'alliage TNZT a été découpée en morceaux d'environ 15 × 15 mm pour la synthèse de TNW par anodisation électrochimique. Les surfaces des échantillons ont été préparées par ponçage avec des papiers abrasifs jusqu'au grain 1200 et polies chimiquement pendant 10 s dans une solution acide composée de HF et HNO3 (1:1). L'anodisation a été réalisée dans une cellule électrolytique d'une capacité volumique d'environ 100 ml (50 mm de diamètre et 50 mm de hauteur) en utilisant une maille de platine de 30 x 30 mm comme cathode. L'échantillon de TNZT, qui était l'anode du système, était en contact avec la solution d'électrolyte à travers une fenêtre ronde de 8 mm de diamètre située à la moitié de la hauteur de la cellule. L'anode et la cathode ont été connectées à une alimentation électrique (Elektro-Automatik 8200–70, Viersen, Allemagne) fonctionnant en mode de tension continue. L'électrolyte a été agité en continu pendant l'anodisation à l'aide d'un barreau d'agitation magnétique. Les paramètres d'anodisation utilisés étaient basés sur une étude antérieure13. Pour développer les TNW, un électrolyte organique contenant de l'éthylène glycol avec 0,5 % en poids de NH4F et 10 % en volume d'eau a été utilisé, et une tension de 20 V a été appliquée pendant 12 h. Immédiatement après l'anodisation, les échantillons ont été rincés avec de l'eau déminéralisée.

Des échantillons de TNZT revêtus de TNT et plats ont été utilisés comme surfaces de contrôle. Bien que les TNT et les TNW présentent des morphologies très différentes, les deux peuvent être synthétisés par un procédé d'anodisation similaire, et l'obtention de l'un ou de l'autre ne dépend que des paramètres utilisés. Des échantillons de TNT ont été choisis comme témoins parce que les TNT ont déjà été largement étudiés et qu'ils sont connus pour présenter une excellente biocompatibilité10. Considérant que les TNT sont plus faciles et plus rapides à obtenir13, l'utilisation des TNW anodisés comme biomatériau ne se justifierait que si leur biocompatibilité était supérieure ou s'ils présentaient tout autre avantage par rapport aux TNT.

Les TNT ont été synthétisés avec une procédure similaire utilisée pour la croissance des TNW, sauf que différents paramètres d'anodisation ont été choisis. Au lieu de l'électrolyte organique, un électrolyte aqueux contenant 0,3 vol.% de HF a été utilisé, et une tension de 20 V a été appliquée pendant 1 h. L'électrolyte aqueux limite l'épaisseur de la couche de TiO2 et empêche la formation de TNWs13. Les échantillons plats ont été produits en ponçant les plaques de TNZT avec du papier abrasif jusqu'à 1200 grains et en les polissant chimiquement pendant 10 s dans une solution acide composée de HF et HNO3 (1:1).

La mouillabilité des surfaces TNW, TNT et TNZT planes a été évaluée en mesurant l'angle de contact entre une goutte d'eau et la surface de l'échantillon, en suivant les directives décrites dans la norme ASTM D7334-0823. Trois procédures de séchage différentes ont été utilisées avant de mesurer l'angle de contact : (i) séchage avec un flux de N2 pendant environ deux minutes, (ii) séchage sous vide et (iii) immersion dans de l'eau déminéralisée pendant 24 h suivie d'un séchage sous vide. Une micropipette fixée en position verticale a été utilisée pour déposer doucement 5 μl d'eau déminéralisée sur la surface de l'échantillon. La forme de la goutte d'eau a été enregistrée à l'aide d'une caméra de microscope numérique portable. L'angle de contact entre la goutte d'eau et la surface a été mesuré à l'aide du plugin d'angle de contact pour le logiciel ImageJ24 et d'au moins trois échantillons pour chaque condition.

La lignée cellulaire précurseur d'ostéoblastes MC3T3-E1 a été obtenue auprès de Sigma – Aldrich (ECACC, n° de catalogue 99072810) et maintenue dans un milieu essentiel minimum alpha (α-MEM; Pan Biotech) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Sigma – Aldrich) et de pénicilline/streptomycine (Dominique Dutcher) à 37 °C et 5 % de CO2, le milieu étant changé tous les 2 jours. Lorsque les cellules sont devenues confluentes, elles ont été détachées et passées en utilisant de la trypsine à 0,25 % (Dominique Dutcher). Avant la culture cellulaire, tous les échantillons ont été stérilisés avec un lavage à l'éthanol (70%) pendant 1 h, suivi d'un lavage à l'eau et d'un rayonnement ultraviolet (UV) pendant 20 min. L'exposition des surfaces de TiO2 aux UV pourrait en principe altérer leur mouillabilité, mais ce changement est inversé lorsque les échantillons sont immergés dans le milieu aqueux pendant la culture cellulaire. Pour les expériences de biocompatibilité, 80 µl de α-MEM complet contenant 6 000 cellules ont été placés au-dessus des surfaces plates TNZT, TNT et TNW. Après 3 h d'incubation, 3 ml du milieu ont été ajoutés aux boîtes de Petri (35 mm) contenant les échantillons.

La prolifération cellulaire a été estimée en mesurant l'absorption d'ester acétoxyméthylique de calcéine toutes les 24 h. Dans les cellules vivantes, la calcéine non fluorescente a été convertie en calcéine verte fluorescente après hydrolyse de l'acétoxyméthyl ester par les estérases intracellulaires. En bref, les cellules ont été incubées à 37 ° C pendant 30 min avec 3 μM de calcéine AM (Molecular Probes, Life Technologies), puis lavées avec du HBSS (Gibco) et visualisées sous un microscope à fluorescence Nikon Eclipse 90i. Au moins cinq champs sélectionnés au hasard ont été capturés et analysés par condition expérimentale à l'aide d'un appareil photo Nikon DXM 1200F. Pour estimer le nombre de cellules positives à la calcéine, les pixels fluorescents totaux ont été comptés par champ, avec un arrière-plan préalablement ajusté pour toutes les images. La version 1.51j8 du logiciel ImageJ (National Institutes of Health, MD, USA) a été utilisée pour l'analyse.

Pour le test MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium), les cellules ont été incubées à 37 ° C avec 0, 5 mg / ml de réactif MTT (Sigma – Aldrich). Après 2 h, 2 ml de 2-propanol ont été ajoutés à chaque plaque de culture et l'absorbance a été mesurée à 560 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Thermo Multiskan Ex). Les mesures MTT ont été effectuées 1, 3 et 5 jours après l'ensemencement des cellules.

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et les données ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 7.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Les pixels positifs à la calcéine et l'analyse MTT ont été comparés entre les groupes au fil du temps à l'aide d'une analyse de variance à deux voies, suivie du test post-hoc de Dunnett.

La morphologie cellulaire a été observée par SEM (Hitachi S-3000N) avec une tension d'accélération de 0,3 à 30 kV. Avant la caractérisation par SEM, les cellules ont été cultivées sur les surfaces du TNW et des échantillons de contrôle pendant 48 h. Ensuite, les cellules ont été fixées, déshydratées, séchées et recouvertes d'or. Le processus de fixation a commencé par quatre lavages consécutifs avec du tampon cacodylate (pH 7,4) pendant 15 min, une fixation avec du glutaraldéhyde à 2 % dans du tampon cacodylate pendant 1 h et une fixation avec du tétroxyde d'osmium à 1 % dans du tampon cacodylate pendant 2,5 h. Après cinq lavages avec H2O distillée, les échantillons ont été incubés avec 1% de tanin dans l'obscurité pendant 1 h pour déshydratation. Les échantillons ont ensuite été déshydratés avec des concentrations croissantes d'éthanol (70 %, 80 %, 90 %, 96 % et 100 %) pendant 10 min chacun et séchés à l'aide de trois solutions d'hexaméthyldisilazane (HMDS) dans les proportions suivantes : une part de HMDS + deux parts d'alcool à 100 % (20 min) ; parties égales de HMDS et d'alcool à 100 % (20 min) ; et trois volumes de HMDS + un volume d'alcool à 100 % (20 min). Enfin, les trois échantillons ont été recouverts d'une fine couche d'Au à l'aide d'un système de métallisation par pulvérisation cathodique Q150T-S (Quorum Technologies).

L'analyse par spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) a été réalisée avec un spectromètre Physical Electronics (PHI Versa Probe II Scanning XPS Microprobe) utilisant un rayonnement monochromatique Al Kα (1486,6 eV, 100 μm, 100 W, 20 kV) comme source d'excitation et un neutraliseur de charge à double faisceau. Les spectres à haute résolution ont été acquis avec une énergie de passage de 29,35 eV et un diamètre de faisceau de rayons X de 100 mm. La base de données de référence standard du NIST25 a été utilisée pour indexer les spectres XPS. Une analyse par diffraction des rayons X (DRX) (balayages 2q) a été réalisée avec un diffractomètre Panalytical X'Pert Pro utilisant un rayonnement Cu-ka (longueur d'onde = 1,5406 Å).

L'analyse XRD de l'alliage TNZT utilisé comme substrat pour la croissance anodique des TNT et des TNW a été effectuée pour confirmer si les échantillons ont la composition de phase attendue. La figure 1 montre le motif obtenu. Toutes les réflexions observées sur la figure proviennent de la phase cubique centrée (β) du titane (base de données du fichier de diffraction de poudre - numéro PDF 01-071-9955), comme prévu pour cet alliage.

Analyse XRD de l'alliage TNZT utilisé comme substrat pour la croissance anodique des TNT et des TNW. Toutes les réflexions observées proviennent de la phase cubique centrée (β) du titane.

L'anodisation des échantillons de TNZT dans l'électrolyte organique a été réalisée à 20 V pendant 12 h et a abouti à ce que toute la surface soit densément recouverte de TNW, comme le montre la Fig. 2a. Les TNW semblaient très flexibles et étaient regroupés en grappes, comme cela avait également été observé dans une étude précédente13. Les TNW se sont développés au-dessus des TNT, comme observé sur la Fig. 2b, conformément au modèle de division du bambou proposé par Lim et Choi12. Les TNT mesuraient environ 4,6 μm de long et 80 nm de diamètre. La figure 2c présente une image à plus fort grossissement des TNW, montrant leur croissance à partir des parois du TNT. La longueur précise des TNW était difficile à mesurer en raison de leur morphologie enchevêtrée, mais ils semblaient être de longueur égale aux TNT. Le diamètre moyen des nanofils était d'environ 28 nm.

Micrographies FEG-SEM d'un échantillon de TNZT anodisé dans l'électrolyte organique à 20 V pendant 12 h, ce qui a entraîné la formation de TNW sur le dessus. (a) Image vue de dessus, (b) image vue en angle et (c) image vue de dessus à un grossissement plus élevé.

Les échantillons revêtus de TNT ont été obtenus par anodisation de l'alliage TNZT avec l'électrolyte aqueux à 20 V pendant 1 h. Des TNT avec une morphologie relativement uniforme ont été générés, avec des parois minces et des bouches bien ouvertes (Fig. 3a). Les nanotubes formés dans cette condition d'anodisation pourraient être divisés en deux groupes en fonction de leurs tailles, comme observé dans une étude antérieure13. Les nanotubes du premier groupe étaient plus longs et plus larges, avec une longueur moyenne de 1,65 μm et un diamètre d'environ 109 nm. Les nanotubes du deuxième groupe entouraient ceux du premier groupe (Fig. 3b) et avaient une longueur d'environ 1,1 μm et un diamètre de 76 nm. La différence de longueur entre les deux groupes était mieux visualisée sur une image de profil (Fig. 3c).

Micrographies FEG-SEM d'un échantillon de TNZT anodisé dans l'électrolyte aqueux à 20 V pendant 1 h. (a,b) Images en vue de dessus et (c) en vue latérale.

Le tableau 2 donne un aperçu des paramètres d'anodisation utilisés et des morphologies résultantes.

La figure 4 montre les analyses XPS pour les échantillons TNT et TNW. Le spectre de sondage (basse résolution) (Fig. 4a) montre la présence d'éléments Ti, Nb, Zr, Ta et O, comme prévu. Les spectres haute résolution de Ti, Nb, Zr, Ta et O (Fig. 4b – f, respectivement) indiquent la présence d'oxydes TiO2, Nb2O5, Ta2O5 et ZrO2 (NIST Standard Reference Database25). Les courbes d'énergie de liaison pour les deux échantillons sont similaires. Le tableau 3 montre la composition en éléments en pourcentage en poids obtenue à partir de l'analyse XPS. Bien que différents électrolytes et temps d'anodisation aient été utilisés pour la synthèse des TNT et des TNW, leur composition chimique est très similaire, il n'est donc pas prévu qu'elle influence la biocompatibilité.

Analyses XPS pour les TNT (anodisation dans l'électrolyte aqueux) (ligne bleue) et TNW (anodisation dans l'électrolyte organique) (ligne rouge). (a) Spectre complet et spectres haute résolution de (b) Ti 2p, (c) Nb 3d, (d) Zr 3d, (e) Ta 4f et (f) O 1s.

La lignée cellulaire précurseur d'ostéoblaste MC3T3-E1 a été cultivée sur les surfaces d'échantillons de TNW et de contrôle (TNT et TNZT plat). La viabilité et la prolifération cellulaires ont été évaluées toutes les 24 h pendant 5 jours par microscopie à fluorescence. La figure 5 montre une image représentative des cellules positives à la calcéine pour chaque surface d'échantillon et chaque point de temps évalué. Une première analyse a révélé que les cellules adhéraient aux trois surfaces et proliféraient. Comme le montre la figure, les cellules cultivées sur les surfaces des échantillons plats de TNZT et de TNT avaient des taux de prolifération élevés et étaient complètement confluentes après 5 jours de culture. Cependant, les cellules cultivées sur la surface TNW ont montré un taux de prolifération considérablement plus faible, avec un nombre de cellules nettement inférieur au fil du temps que sur les surfaces planes et TNT. Pour quantifier la prolifération cellulaire, nous avons estimé l'intensité de fluorescence dans les images microscopiques en comptant le nombre de pixels verts par image dans les conditions expérimentales (Fig. 6a). Les résultats ont montré un nombre similaire de pixels verts pour les échantillons plats et TNT, sans différences significatives. Cependant, le nombre de pixels était significativement plus faible pour l'échantillon TNW à tous les moments évalués et environ 49 % inférieur à ceux des deux autres échantillons après 5 jours de culture. De plus, la viabilité des cellules a été évaluée par le test MTT après 1, 3 et 5 jours de culture (Fig. 6b). Bien que les différences ne soient pas statistiquement significatives, les résultats ont montré la même tendance générale que ceux obtenus par la méthode de comptage des pixels, indiquant que l'échantillon TNW a un nombre inférieur de cellules viables par rapport aux deux autres surfaces après 5 jours de culture.

Images de microscopie à fluorescence de cellules MC3T3-E1 colorées à la calcéine aux jours 1 à 5 de culture sur les surfaces du matériau poli chimiquement, des TNT et des TNW.

Prolifération et viabilité des cellules MC3T3-E1 après différents temps de culture sur les surfaces des échantillons TNW et témoins (TNZT et TNT plats), évaluées par microscopie à fluorescence (a) et par le test MTT (b). Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001 par rapport aux échantillons plats de TNZT (analyse de variance à deux voies, suivie du test post-hoc de Dunnett).

Pour observer plus en détail la morphologie des cellules sur les surfaces des différents échantillons, une MEB a été réalisée après 48 h de culture. La figure 7 montre des images à faible grossissement des cellules sur la surface TNW, ainsi que sur les échantillons de contrôle (TNZT plat et TNT). Semblables aux images de microscopie à fluorescence, les échantillons plats et TNT (Fig. 7a, b) avaient des densités élevées de cellules, qui recouvraient presque entièrement les surfaces. En revanche, l'échantillon TNW (Fig. 7c) a montré un nombre significativement inférieur de cellules. La figure 8 montre des images à plus fort grossissement des cellules à la surface des échantillons plats de TNZT, TNT et TNW. Les cellules ensemencées sur des échantillons TNW semblent avoir une morphologie et des filopodes plus allongés ; cependant, les futures études d'immunohistochimie, c'est-à-dire l'actine/vinculine, aideront à déterminer l'impact que les différentes surfaces pourraient avoir sur la dynamique du cytosquelette. De plus, dans les images SEM, les TNW peuvent être observés à la surface, sans aucun dommage apparent pouvant affecter l'adhésion et la prolifération cellulaire.

Micrographies électroniques à balayage de cellules MC3T3-E1 après 48 h de culture sur les surfaces des échantillons (a) TNZT plats, (b) TNT et (c) TNW.

Micrographies électroniques à balayage de cellules MC3T3-E1 après 48 h de culture. (a) TNZT plats, (b) TNT et (c) TNW.

Une des propriétés importantes des biomatériaux qui pourrait expliquer les différences observées lors de la prolifération cellulaire en culture est la mouillabilité de la surface, qui peut affecter sa biocompatibilité. La mesure de l'angle de contact est la méthode la plus courante pour évaluer la mouillabilité. La figure 9 montre les résultats des mesures d'angle de contact pour les échantillons plats TNZT, TNT et TNW (plus l'angle de contact est faible, plus la mouillabilité est élevée). L'angle de contact pour les surfaces plates de TNZT et de TNT était d'environ 86° et 75°, respectivement. La mouillabilité des TNW a été influencée par la méthode de séchage après anodisation. Le séchage avec un flux de N2, qui est une méthode courante pour sécher les TNT anodisés, a entraîné un angle de contact relativement faible d'environ 19°. Les TNW obtenus dans cette étude sont longs et denses, ce qui peut être plus difficile à sécher, ce qui a soulevé un doute quant à savoir si le flux de N2 était suffisant pour éliminer toute l'eau éventuellement piégée dans la nanostructure. Pour clarifier cela, certains échantillons TNW ont été séchés sous vide pendant 24 h, ce qui a entraîné un angle de contact significativement plus élevé d'environ 63°. Ainsi, l'étape de séchage sous vide avant la mesure de l'angle de contact était essentielle pour une mesure correcte. De plus, certains échantillons ont été immergés dans l'eau pendant 24 h avant séchage, pour simuler l'environnement aqueux dans lequel les échantillons sont soumis lors de la culture cellulaire d'ostéoblastes. Cette immersion dans l'eau n'a pas eu d'influence significative sur la mouillabilité, résultant en un angle de contact d'environ 57°.

Mesures de mouillabilité (angle de contact) des surfaces planes TNZT, TNT et TNW. L'influence de la méthode de séchage après anodisation pour les échantillons TNW est montrée.

La mouillabilité plus élevée des TNT par rapport à celle de la surface plane était attendue en raison de l'effet capillaire10, bien que la mouillabilité puisse varier de manière significative en fonction de la morphologie des nanotubes et des paramètres d'anodisation10,26,27. À ce jour, aucune étude n'a été menée sur la mouillabilité des TNW anodiques, mais leur rugosité de surface et leur perméabilité élevées pourraient expliquer leur mouillabilité significativement plus élevée. L'examen de Menzies et Jones28 sur l'impact de l'angle de contact sur la biocompatibilité des biomatériaux a conclu que bien qu'une surface hydrophobe soit connue pour réduire la biocompatibilité, une surface hautement hydrophile pourrait également être préjudiciable car elle empêche les interactions cellule-cellule. Lee et al.29 ont étudié le comportement des cellules sur une surface avec un gradient de mouillabilité (angle de contact variant de 30° à 90°) et ont observé qu'à 50° les cellules présentaient la meilleure adhésion. Il semble qu'il existe un angle de contact intermédiaire (ni trop faible ni trop élevé) qui serait optimal. Bien que la mouillabilité de la surface TNW semble présenter une bonne valeur, d'autres facteurs ont probablement une plus grande pertinence pour sa biocompatibilité.

Les cellules MC3T3-E1 ont montré une prolifération similaire sur les surfaces des échantillons plats de TNZT et de TNT, indiquant que les deux échantillons de contrôle avaient une bonne biocompatibilité. La forte prolifération à la surface du TNT était attendue sur la base des données d'autres études17, et une prolifération cellulaire similaire à la surface des TNT et du Ti plat a également été observée par Chang et al.22. Comme commenté dans l'introduction, seules quelques études ont évalué l'activité des cellules osseuses sur des surfaces recouvertes de TNW ou de TNF (Tableau 1). Bien que certaines de ces études aient montré une prolifération accrue des cellules sur les surfaces des TNW par rapport à celle sur les surfaces planes, une prolifération réduite ou similaire a été observée dans quatre des six études répertoriées dans le tableau 1. Les méthodes de synthèse ainsi que la morphologie et les dimensions des nanostructures variaient considérablement d'une étude à l'autre.

La topographie et la morphologie de surface devraient affecter la biocompatibilité des TNW. Il a été rapporté que le diamètre et la taille des pores des nanofils / nanofibres affectent la réponse cellulaire. Badami et al.30 ont étudié la prolifération et la différenciation des cellules MC3T3-E1 sur des fibres polymères avec des diamètres allant d'environ 140 nm à 2,1 μm et ont observé que les diamètres de fibre plus petits entraînaient une densité cellulaire plus faible et empêchaient l'infiltration cellulaire dans les fibres. L'infiltration est un paramètre essentiel de la formation osseuse car les cellules s'infiltrent et produisent des protéines de la matrice osseuse16. Les diamètres des TNW/TNF obtenus par électrofilage18,19, oxydation thermique20 et dépôt de couche atomique21 étaient significativement plus grands que ceux des TNW obtenus dans cette étude ou dans d'autres études qui utilisaient l'anodisation électrochimique comme méthode de synthèse. Une autre différence critique est que les nanofils à croissance anodique sont beaucoup plus denses, avec pratiquement pas de pores ni d'espace libre.

Les TNW et les TNF peuvent être synthétisés par diverses méthodes, et leurs dimensions et morphologies peuvent varier considérablement en fonction de la méthode et des paramètres utilisés. Le nombre d'études sur la prolifération des cellules ostéoblastiques à la surface de ces nanostructures est encore très limité, et les résultats ne sont pas concluants. Bien que certaines études indiquent que l'utilisation des TNW/TNF pour des applications biomédicales est prometteuse, les paramètres affectant la prolifération cellulaire doivent être mieux compris. De plus, les longs TNW obtenus par anodisation électrochimique de l'alliage TNZT offrent une surface spécifique très élevée qui pourrait être avantageuse pour d'autres applications potentielles, telles que la catalyse31, les biocapteurs32 et les systèmes d'administration de médicaments33.

Un problème de sécurité supplémentaire qui nécessite une attention est l'endommagement possible des nanostructures de TiO2 implantées. Les implants sont fréquemment soumis à des conditions tribologiques pouvant entraîner la libération de débris solides et entraîner des réactions inflammatoires péri-implantaires. Comme expliqué dans "Introduction", les TNW à croissance anodique sont formés par la division verticale des TNT lors de l'anodisation, ce qui se traduit par une double morphologie formée de nanotubes avec des nanofils sur le dessus. Cette nanostructure doit être protégée d'une rupture ou d'un détachement du substrat. Pour les TNT, on trouve des études sur leur stabilité mécanique. Des résultats prometteurs ont été trouvés par Shivaram et al.34, qui ont réalisé une implantation ex-vivo de titane recouvert de TNT et n'ont observé aucun dommage significatif pour les TNT jusqu'à 1 mm de long. La résistance au cisaillement des revêtements de TNT a été étudiée par Cao et al.35 et ils ont observé que l'adhérence au substrat est plus élevée pour les TNT plus courts. Aucune étude sur la stabilité mécanique des TNW anodiques n'a été trouvée dans la littérature, un sujet qui devra être abordé dans le futur. Le diamètre des TNW anodiques est considérablement plus fin que celui des TNW produits par d'autres méthodes de synthèse (tableau 2), ce qui leur confère une grande flexibilité (comme le montre sa morphologie sur la figure 1) en raison de la moindre déformation pour un rayon de courbure donné. Cette flexibilité pourrait éventuellement aider à éviter les dommages mécaniques.

Cette étude a évalué la viabilité et la prolifération des cellules précurseurs ostéoblastiques MC3T3-E1 à la surface des TNW cultivés par anodisation électrochimique sur l'alliage TNZT. Du TNT enrobé et du TNZT plat ont été utilisés comme échantillons de contrôle. L'alliage TNZT s'est avéré être un substrat approprié pour la croissance des TNW, permettant la croissance de longues nanostructures de TiO2. La prolifération des cellules MC3T3-E1 sur les surfaces planes du TNZT et du TNT était similaire et relativement élevée. La prolifération cellulaire sur l'échantillon TNW était au moins environ 25 % inférieure à celle sur les échantillons témoins après 5 jours de culture. Malgré l'observation que les cellules de l'échantillon TNW avaient moins d'activité métabolique, ces différences n'étaient pas statistiquement significatives, ce qui indique que la survie des cellules était similaire dans les trois conditions expérimentales différentes. Les TNW ont montré un niveau modéré d'hydrophilie, tandis que la mouillabilité des échantillons témoins était considérablement plus élevée. Cela devrait, en principe, représenter une biocompatibilité améliorée pour la surface TNW ; cependant, d'autres facteurs peuvent jouer un rôle plus important, tels que la topographie de surface et la morphologie TNW. D'autres études sont nécessaires pour comprendre tous les paramètres affectant la prolifération des cellules ostéoblastiques à la surface des TNW et d'autres nanostructures similaires. Les TNW longs obtenus dans cette étude ont un rapport surface/volume élevé qui peut également être utile pour d'autres applications.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude actuelle sont disponibles dans le référentiel ZENODO, https://doi.org/10.5281/zenodo.6345229.

Boyer, RR Un aperçu de l'utilisation du titane dans l'industrie aérospatiale. Mater. Sci. Ing. A 213, 103-114 (1996).

Article Google Scholar

Kaur, M. & Singh, K. Examen du titane et des alliages à base de titane en tant que biomatériaux pour les applications orthopédiques. Mater. Sci. Ing. C 102, 844–862 (2019).

Article CAS Google Scholar

Ridzwan, MIZ, Shuib, S., Hassan, AY, Shokri, AA et Mohammad Ibrahim, MN Problème de protection contre les contraintes et amélioration des conceptions d'implants de hanche : un examen. J. Med. Sci. 7, 460–467 (2007).

Article Google Scholar

Bahraminasab, M., Sahari, BB, Edwards, KL, Farahmand, F. & Arumugam, M. Desserrage aseptique des composants fémoraux : considérations d'ingénierie et de conception des matériaux. Mater. Dés. 44, 155-163 (2013).

Article CAS Google Scholar

Nasibi, S. et al. Alliage TZNT pour les applications d'implants chirurgicaux : une revue systématique. J. Compos. Compd. 2, 61–67 (2020).

Google Scholar

Qazi, JI & Rack, HJ Alliages de titane bêta métastables pour applications orthopédiques. Adv. Ing. Mater. 7, 993–998 (2005).

Article CAS Google Scholar

Kopova, I. et al. Alliages de titane bêta biomédicaux Ti-Nb-Zr-Ta-Si-Fe nouvellement développés avec une résistance accrue et une biocompatibilité améliorée. Mater. Sci. Ing. C 60, 230-238 (2016).

Article CAS Google Scholar

Sharan, J., Lale, SV, Koul, V., Mishra, M. & Kharbanda, OP Un aperçu des modifications de surface du titane et de ses alliages pour les applications biomédicales. Tendances Biomater. Artef. Organes 29, 176-187 (2015).

Google Scholar

Porrelli, D. et al. Traitements de surface polyétheréthercétone et titane pour modifier la rugosité et la mouillabilité : Amélioration de la bioactivité et des propriétés antibactériennes. J. Mater. Sci. Technol. 95, 213–224 (2021).

Article Google Scholar

Indira, K., Mudali, Royaume-Uni, Nishimura, T. & Rajendran, N. Une revue sur les nanotubes de TiO2 : Influence des paramètres d'anodisation, mécanisme de formation, propriétés, comportement à la corrosion et applications biomédicales. J. Bio-Tribo-Corros. 1, 28 (2015).

Article Google Scholar

Macak, JM et al. Nanotubes de TiO2 : Formation électrochimique auto-organisée, propriétés et applications. Courant. Avis. Matériau à l'état solide. Sci. 11, 3–18 (2007).

Article ADS CAS Google Scholar

Lim, JH & Choi, J. Nanofils d'oxyde de titane provenant de nanotubes à croissance anodique : le modèle de séparation du bambou. Petit 3, 1504-1507 (2007).

Article CAS Google Scholar

Fanton, L., Cremasco, A., Mello, MG & Caram, R. Croissance par anodisation de nanotubes de TiO2 sur un alliage Ti–35Nb–7Zr–5Ta : effets du temps d'anodisation, de l'écrouissage et de la texture cristallographique. J. Mater. Sci. 54, 13724–13739 (2019).

Article ADS CAS Google Scholar

Tan, AW, Pingguan-Murphy, B., Ahmad, R. & Akbar, SA Progrès dans la fabrication de réseaux de nanofibres/nanofils de TiO2 vers la réponse cellulaire dans les implantations biomédicales : une revue. J. Mater. Sci. 48, 8337–8353 (2013).

Article ADS CAS Google Scholar

Matlock-Colangelo, L. & Baeumner, AJ Progrès récents dans la conception de dispositifs de biodétection à base de nanofibres. Puce de laboratoire 12, 2612 (2012).

Article CAS Google Scholar

Moy, J., Limaye, A. & Arinzeh, TL Échafaudages fibreux pour l'ingénierie des tissus osseux. Dans Nanofibres artificielles de protéines et de peptides 351–382 (Elsevier, 2020).

Chapitre Google Scholar

Cheng, Y. et al. Progrès des revêtements de nanotubes de TiO 2 pour les applications biomédicales : un bilan. J. Mater. Chim. B 6, 1862–1886 (2018).

Article CAS Google Scholar

Chen, SJ, Yu, HY & Yang, BC Films de fibres de TiO 2 bioactifs préparés par la méthode d'électrofilage. J. Biomed. Mater. Rés. Partie A 101A, 64–74 (2013).

Article CAS Google Scholar

Wang, X. et al. Effets des propriétés structurelles des mailles de nanofibres de TiO 2 électrofilées sur leur potentiel ostéogénique. Acta Biomater. 8, 878–885 (2012).

Article CAS Google Scholar

Dinan, B., Gallego-Perez, D., Lee, H., Hansford, D. & Akbar, SA Nanofils de TiO2 à croissance thermique pour améliorer la croissance et la prolifération cellulaires sur des matériaux à base de titane. Céram. Int. 39, 5949–5954 (2013).

Article CAS Google Scholar

Huang, Z. et al. Effet des surfaces revêtues de nanofibres sur la prolifération et la différenciation des ostéoprogéniteurs in vitro. Tissue Eng. Partie A 14, 1853–1859 (2008).

Article CAS Google Scholar

Chang, CH et al. Un nouveau procédé d'anodisation électrochimique rotative pour fabriquer des nanostructures de surface en oxyde de titane améliorant la bioactivité des cellules ostéoblastiques. J. Biomed. Mater. Rés. Partie A 100A, 1687–1695 (2012).

Article CAS Google Scholar

(ASTM). D7334 - 08, Pratique standard pour la mouillabilité de surface des revêtements, des substrats et des pigments en avançant la mesure de l'angle de contact. Annu. B. Support ASTM. 08, 1–3 (2008).

Schneider, CA, Rasband, WS & Eliceiri, KW NIH Image to ImageJ : 25 ans d'analyse d'images. Nat. Méthodes 9, 671–675 (2012).

Article CAS Google Scholar

Base de données de spectroscopie photoélectronique à rayons X du NIST. Base de données de référence standard NIST numéro 20 https://srdata.nist.gov/xps/. https://doi.org/10.18434/T4T88K (2012).

Liu, G., Du, K. & Wang, K. Mouillabilité de surface des réseaux de nanotubes de TiO2 préparés par anodisation électrochimique. Appl. Le surf. Sci. 388, 313–320 (2016).

Article ADS CAS Google Scholar

Thaik, N., Kooptarnond, K., Meesane, J. & Khangkhamano, M. Effet du temps d'anodisation sur la morphologie et la mouillabilité des nanotubes de TiO2 préparés par cathode de carbone. Mater. Sci. Forum 962, 145-150 (2019).

Article Google Scholar

Menzies, KL & Jones, L. L'impact de l'angle de contact sur la biocompatibilité des biomatériaux. Optom. Vis. Sci. 87, 387–399 (2010).

Article Google Scholar

Lee, JH, Lee, JW, Khang, G. & Lee, HB Interaction des cellules sur des surfaces de gradient de groupe fonctionnel chargeable. Biomatériaux 18, 351–358 (1997).

Article ADS CAS Google Scholar

Badami, AS, Kreke, MR, Thompson, MS, Riffle, JS & Goldstein, AS Effet du diamètre des fibres sur la propagation, la prolifération et la différenciation des cellules ostéoblastiques sur des substrats de poly (acide lactique) électrofilés. Biomatériaux 27, 596–606 (2006).

Article CAS Google Scholar

Wang, K. et al. Synthèse in situ de nanostructures de TiO2 sur une feuille de Ti pour des performances photocatalytiques améliorées et stables. J. Mater. Sci. Technol. 35, 615–622 (2019).

Google Scholar

Wang, X. et al. Application de nanofils de dioxyde de titane et d'électrodes modifiées à l'oxyde de graphène électroréduit pour la détection électrochimique de la séquence spécifique du gène tlh de Vibrio parahaemolyticus. Anal. Méthodes 7, 2623–2629 (2015).

Article CAS Google Scholar

Jarosz, M., Kapusta-Kołodziej, J., Pawlik, A., Syrek, K. & Sulka, GD Systèmes d'administration de médicaments basés sur des nanostructures de titane. Dans Nanostructures pour l'administration de médicaments 299–326 (Elsevier, 2017).

Chapitre Google Scholar

Shivaram, A., Bose, S. & Bandyopadhyay, A. Dégradation mécanique des nanotubes de TiO2 avec et sans revêtement d'argent nanoparticulaire. J. Mech. Comportement Biomédical. Mater. 59, 508-518 (2016).

Article CAS Google Scholar

Cao, S., Huang, W., Wu, L., Tian, M. & Song, Y. Sur l'adhérence interfaciale entre la couche de réseau de nanotubes de TiO2 et le substrat de Ti. Langmuir 34, 13888–13896 (2018).

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Ce travail a été soutenu par l'agence brésilienne de financement de la recherche FAPESP (São Paulo Research Foundation) [Grant number 2019/01760-5] ; l'Agence nationale espagnole de la recherche (AEI) et le ministère espagnol des Sciences, de l'Innovation et des Universités à travers le projet CALYPSOL-ATECWATER [numéro de subvention RTI2018-097997-B-C33] ; et Comunidad de Madrid à travers le programme REMTAVARES [Grant number P2018/EMT-4341].

École de génie mécanique, Université de Campinas (Unicamp), Rua Mendeleyev, 200, Campinas, São Paulo, 13083-860, Brésil

Léonard Fanton

Département de technologie chimique et environnementale, Université King Juan Carlos, C/ Tulip S/N, Mostoles, 28933, Madrid, Espagne

Leonardo Fanton, Cristina Adán, Rafael A. García-Muñoz & Javier Marugán

Laboratoire de soutien à la recherche, Hôpital universitaire Fundación Alcorcón, C/ Budapest 1, Alcorcón, 28922, Madrid, Espagne

Frida Loria, Mario Amores et M. Ruth Pazos

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

LF a conçu l'étude, réalisé une partie du travail expérimental et rédigé le manuscrit principal. FL, MA et MRP ont réalisé et interprété les expériences de biocompatibilité, discuté des résultats et rédigé une partie du manuscrit. CA a supervisé l'étude, préparé les échantillons, analysé les résultats et rédigé une partie du manuscrit. RAG a participé à la conceptualisation de l'étude et à la discussion des résultats. JM était le superviseur principal, a conçu l'étude, analysé les résultats et participé au processus de rédaction. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Javier Marugán.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Fanton, L., Loria, F., Amores, M. et al. Prolifération de cellules précurseurs d'ostéoblastes à la surface de nanofils de TiO2 anodiquement développés sur un alliage de titane biomédical de type β. Sci Rep 12, 7895 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11981-4

Télécharger la citation

Reçu : 05 mars 2022

Accepté : 04 mai 2022

Publié: 12 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-11981-4

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.